鼠角質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)有哪幾點

 實驗步驟

1) 將 1~2 天齡新生裸鼠窒息后，置于培養(yǎng)皿中，用 1% 碘聚乙烯吡咯烷酮液洗凈裸鼠, 流水*沖洗，然后用 70% 乙醇洗兩次。
 
2) 上除小鼠的四肢和尾巴。
 
3) 將小鼠從尾巴至鼻子的皮膚作一簡單切口，用大鼠牙齒鑷輕輕將整個身體的皮膚剝下，用一把鑷子夾住身體，另一把鑷子拉開皮膚。
 
4) 將剝下的皮膚組織置于放在冰上的無菌培養(yǎng)皿表面，直至所有的皮膚收集完畢。
 
5) 用 2 把大鼠牙齒鉗夾住皮膚組織，在含 2.5% 胰蛋內(nèi)酶的 HBSS 無菌培養(yǎng)皿中漂洗皮膚組織（組織在下），然后置 4℃過夜。表皮不應(yīng)淹沒在胰蛋白酶液中。6) 從胰蛋白酶處理液中取出組織，將表皮面朝下置于干燥的無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿表面。
 
7) 用剪刀小心地將表皮殘留物剪碎，置于含「常規(guī)」培養(yǎng)液（MEM 含 10%FCS,100IU/ml 青霉素，100ug/ml 鏈霉素，2~4 mmol/L L-谷氨酰胺；每 5 只小鼠皮膚用10 ml) 的無菌燒瓶中，磁力攪拌器 37℃劇烈攪拌 45 分鐘。
 
8) 用 4 層無菌 Nitex 紗布（16xx 孔，Martin 提供）過濾液體。
 
當(dāng)其他細(xì)胞通過時角質(zhì)層細(xì)胞留在紗布的表面。
 
9) 用培養(yǎng)液將細(xì)胞洗下，培養(yǎng)基的用量約為一塊皮膚 10 ml, 將細(xì)胞接種于塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶中或玻璃蓋玻片上，37℃ 培養(yǎng) 4~12 小時。
 
也可將細(xì)胞離心后收集沉淀（800 g，10 分鐘），用含 10%DMSO 的培養(yǎng)液再懸細(xì)胞，凍存下于液氮中以備用。
 
10)4~12 小時后觀察培養(yǎng)皿表面的細(xì)胞群。
 
11) 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至低鈣培養(yǎng)液，角質(zhì)細(xì)胞將開始繁殖。